Desenvolvimento de linhagens germinativas de peixes transgênicos para o gene do hormônio do crescimento (GH) utilizando o paulistinha Danio rerio (Cypriniformes; Cyprinidae) como modelo experimental
Autor: Marcio de Azevedo Figueiredo (Currículo Lattes)
Orientador: Dr Luis Fernando Fernandes Marins
Resumo
O objetivo deste trabalho foi produzir linhagens germinativas transgênicas do paulistinha (Danio rerio) para o gene do hormônio do crescimento (GH) através da técnica de co-injeção utilizando o gene marcador da proteína verde fluorescente (GFP). Para atingir este objetivo, na primeira parte deste trabalho foram determinadas as condições a serem utilizadas para a produção dos peixes transgênicos. Para isto, foram microinjetadas em ovos recém fertilizados, duas concentrações diferentes da construção genética contendo o gene da GFP associado ao promotor da -actina da carpa (Cyprinus carpio). Os resultados obtidos demonstraram que a concentração de 18,3 ng/L foi mais eficiente na produção de indivíduos transgênicos em relação à concentração de 3,7 ng/L. Na segunda parte deste estudo, foi utilizada a estratégia de co-injeção do gene do GH com o gene marcador para avaliar o grau de mosaicismo in vivo e identificar paulistinhas transgênicos com potencial para gerar linhagens germinativas para o gene de interesse. As duas construções, reguladas pelo mesmo promotor, foram co-injetadas linearizadas numa proporção equimolar (1:1). O gene do GH utilizado foi o do peixe rei-marinho Odonthestes argentinensis (msGH). Após a eclosão, as larvas foram observadas em microscópio de epifluorescência, e as que apresentaram uma expressão forte para a GFP foram cultivadas até a maturidade sexual, quando foram reproduzidas com indivíduos não-transgênicos. Os peixes G1 positivos para a expressão da GFP foram analisados por PCR de DNA genômico para a presença do gene do msGH. Isto permitiu identificar dois indivíduos G0 (M0104 e F0104) que transmitiram os dois transgenes para a G1. Os animais da G1 que carregavam ambos transgenes foram reproduzidos com não-transgênicos. A análise da G2 demonstrou que na linhagem M0104 os transgenes integraram-se em cromossomos diferentes, e que na linhagem F0104 os dois transgenes integraram-se no mesmo cromossomo. Na terceira parte deste trabalho, foram realizados experimentos de crescimento entre transgênicos homozigotos, hemizigotos e não-transgênicos da linhagem F0104. Os resultados destes experimentos demonstraram que os animais hemizigotos apresentaram um crescimento significativamente maior do que os demais, o que pode ser explicado pelo aumento significativo da expressão do gene do IGF-I (Fator de crescimento tipo-insulina I) observado nesta classe. Embora os transgênicos homozigotos tenham apresentado, como esperado, uma maior expressão do gene do msGH, não foi detectada a expressão do gene do IGF-I. Este fato pode explicar os resultados dos experimentos de crescimento. A metodologia aplicada no presente estudo permitiu inferências sobre os eventos de integração dos transgenes utilizados, possibilitando a identificação de uma linhagem que estava transmitindo ambos transgenes ligados no mesmo cromossomo. No modelo experimental aqui desenvolvido, peixes transgênicos hemizigotos mostraram-se mais viáveis para o cultivo. Estes resultados podem, no futuro, ser aplicados para a produção de linhagens geneticamente modificadas de espécies de peixes comercialmente importantes com maior performance de crescimento.